icon320x320        argenta-logo-jakosc

Autor: Dorota Merlak

 

Próbki z obszaru łańcucha żywnościowego badane są pod kątem wykrywania lub oznaczania liczby Listeria sp. oraz Listeria monocytogenes. Badanie przeprowadza się metodą znormalizowaną zgodną z PN EN ISO 11290 (zeszyt 1 i 2), albo metodami alternatywnymi opartymi na technikach hodowlanych, testach immunologicznych bądź PCR. Metoda znormalizowana polega na dwuetapowym namnażaniu próbki w bulionie selektywno-namnażającym, a następnie na hodowli na pożywkach selektywnych i wykonaniu szeregu badań potwierdzających. Badania potwierdzające wykonuje się dla charakterystycznych kolonii wyrosłych na pożywkach selektywno-różnicujących, po ich przesianiu na agar odżywczy. Do przesiewów można użyć agaru z krwią, co pozwala jednocześnie ocenić zdolność izolatów do hemolizy. W opublikowanej w tym roku nowej wersji normy ISO 11290, do potwierdzeń Listeria dopuszczono wykorzystanie komercyjnych testów identyfikacyjnych, które wykorzystują reakcje biochemiczne wyspecyfikowane w normie.


Jednym z takich testów identyfikacyjnych zgodnych z normą ISO 11290 jest Oxoid™ Microbact™ Listeria 12L firmy Thermo Scientific™. Każdy pasek testowy składa się z 12 analiz wykrywających: hydrolizę eskuliny, wykorzystanie dziesięciu węglowodanów oraz mikro-hemolizę. Badane kolonie (katalazo-dodatnie, oksydazo-ujemne, ruchliwe w 25°C, krótkie Gram-dodatnie pałeczki) zawieszane są w płynie do rozcieńczeń dołączonym do zestawu, a następnie inkubowane. Okres inkubacji zależny jest od gęstości inokulum. Dla gęstości odpowiadającej 0,5 stopnia MacFarlanda czas inkubacji wynosi 4 godziny, a dla zawiesiny jednej kolonii – 18 do 24 godzin. Rezultaty testów na wykorzystanie węglowodanów odczytywane są na podstawie wyraźnych zmian zabarwienia. Odczyt hemolizy polega na obserwacji krwinek. Osadzenie się krwinek na dnie studzienki oznacza ujemny wynik testu na hemolizę. Wszystkie wyniki mogą być interpretowane za pomocą tabel dołączonych do testu lub przy wykorzystaniu programu komputerowego Microbact® Identification Package.

 

Oxoid Microbact Listeria 12L  Thermo Scientific.jak-zmniejszyc-fotke pl

 

Oxoid™ Microbact™ Listeria 12L  Thermo Scientific

 

Tradycyjne biochemiczne testy identyfikacyjne są czasochłonne i wymagają inkubacji. Do wstępnej identyfikacji podejrzanych kolonii wyrosłych na pożywkach selektywnych doskonale sprawdzają się więc testy immunologiczne w formacie aglutynacji lateksowej. Oxoid™ Listeria Test Kit (Thermo Scientific™) pozwala wstępnie zidentyfikować Listeria sp. z uzyskanych hodowli nawet 24-48 godzin wcześniej niż jest to możliwe przy użyciu metod konwencjonalnych. Cząsteczki lateksu opłaszczone są poliwalentnymi przeciwciałami przeciwko oczyszczonym białkom rzęskowym pochodzącym z Listeria monocytogenes (antygen A, B i C) i L. grayi (antygen E). W obecności tych antygenów cząsteczki lateksu aglutynują tworząc duże, widoczne strąty. Natomiast w przypadku braku antygenów cząsteczki lateksu pozostają na polu testowym w postaci gładkiej zawiesiny. Oxoid™ Listeria Test Kit wykrywa wszystkie ruchliwe szczepy Listeria sp. Do pełnej identyfikacji gatunkowej test powinien być używany w połączeniu z analizą biochemiczną (np. Microbact ™ 12L Kit).


Stosowanie metod hodowlanych, alternatywnych w stosunku do metody znormalizowanej, staje się coraz popularniejsze ze względu na ich prostotę wykonania i krótszy czas uzyskania wyniku. Dzięki zastosowaniu innowacyjnych bulionów namnażających i pożywek selektywno-różnicujących oraz różnych wariantów etapu potwierdzeń, wynik ujemny uzyskuje się już po 48 godzinach. Wynik dodatni potwierdzany jest metodami znormalizowanymi. Do rodziny takich metod należy metoda Listeria Precis™, zwalidowana przez AFNOR zgodnie z normą EN ISO 16149, która oparta jest na zasadzie: jeden bulion namnażający - jedna pożywka selektywno-różnicująca - jeden test potwierdzający. Metoda charakteryzuje się wysoką specyficznością i czułością potwierdzoną w badaniach walidacyjnych AFNOR (raport walidacyjny dostępny jest u producenta).


Gwałtowny rozwój biologii molekularnej otworzył nowe możliwości również w diagnostyce Listeria. Do wykrywania Listeria sp. i Listeria monoctogenes wykorzystywana jest metoda PCR w tym Real Time PCR, zarówno w systemach zamkniętych, jak i otwartych. Etap izolacji DNA można wykonywać manualnie lub automatycznie, natomiast detekcja produktów amplifikacji, jak i analiza uzyskanych danych, jest w pełni zautomatyzowana. Dla otwartych systemów do izolacji DNA można wykorzystać urządzenia z magnetyczną separacją, takie jak King Fisher™ Thermo Fisher Scientific™. Główną zaletą automatycznej izolacji jest otrzymywanie wysokiej jakości oczyszczonych próbek wyizolowanego DNA/RNA/białek przy minimalnym nakładzie pracy. Urządzenie KingFisher™ Duo Prime sprawdzi się w laboratoriach pracujących z małą liczbą próbek, zapewniając wysoką wydajność, powtarzalność i niezawodność. Jeden cykl umożliwia izolację 24 próbek o objętości od 30μl do 5ml. W przypadku większej ilości próbek można zastosować KingFisher™ Flex, który pozwala na jednorazową izolację 96 próbek.

King Fisher Thermo Fisher Scientific


King Fisher™ Thermo Fisher Scientific


W badaniu wielu próbek jednocześnie, rozwiązaniem najbardziej ekonomicznym jest system do łączenia i zagęszczania wstępnie namnożonych próbek, taki jak Pathatrix®. Urządzenie to daje możliwość łączenia do 10 próbek w jedną próbkę analityczną, a tym samym redukuje koszty badań nawet o 90%. Wykorzystanie opłaszczonych przeciwciałami kuleczek magnetycznych zapewnia izolację specyficznych bakterii spośród flory towarzyszącej oraz oczyszcza próbkę z inhibitorów reakcji PCR.

 

Pathatrix

Pathatrix


Po etapie izolacji DNA, amplifikacja oraz detekcja zachodzą w termocyklerze w ciągu kilkudziesięciu minut. Termocykler Applied Biosystems® 7500 Fast Real-Time PCR to jedno z najbardziej uniwersalnych urządzeń na rynku. Wiele kanałów detekcji oraz możliwość kalibracji barwników we własnym zakresie, zapewnia szeroką gamę kierunków badań. W diagnostyce Listeria do dyspozycji laboratoriów są gotowe zestawy testowe. W zestawie MicroSEQ® Listeria monocytogenenes odczynniki w postaci gotowej do użycia, liofilizowanej tabletki, umieszczone są już w probówce do PCR. Pozwala to wyeliminować pracochłonny etap samodzielnego przygotowywania mieszaniny reakcyjnej i, co najważniejsze, zmniejsza ryzyko przypadkowej kontaminacji próbek. Testy zawierają także wbudowaną kontrolę wewnętrzną (IPC - internal positive control). Dzięki IPC wiemy, że reakcja PCR przebiegła prawidłowo i zachowane zostały parametry procesu. Potwierdzeniem wysokiej jakości testów są certyfikaty AOAC oraz AFNOR. Całkowity czas wykonania oznaczenia razem z namnożeniem próbki to 18-24 godzin.

Termocykler Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR

Termocykler Applied Biosystems® 7500 Fast Real-Time PCRTermocykler Applied Biosystems® 7500 Fast Real-Time PCR

 

MicroSEQ Listeria monocytogenenes

MicroSEQ® Listeria monocytogenenes

 

Wszystkie wyżej opisane techniki pozwalają na wykrycie lub oznaczenie liczby Listeria, w tym Listeria monocytogenes, we wszystkich rodzajach próbek żywności, z coraz lepszą dokładnością, przy mniejszym nakładzie pracy i w krótszym czasie. Laboratoria mikrobiologiczne mogą wybrać najdogodniejszą dla siebie metodę, biorąc pod uwagę ilość wykonywanych oznaczeń, wyposażenie laboratorium oraz ograniczenia czasowe uzyskiwania potwierdzonych wyników. Niezbędne w każdej technice jest jednak zapewnienie wysokiej jakości badań poprzez nadzór nad personelem, wyposażeniem i prowadzenie stałej kontroli uzyskiwanych wyników.

Wiadomości