Szczegóły

Utworzono: piątek, 25, marzec 2011 11:18

Real-Time PCR

Ulepszeniem reakcji PCR jest reakcja PCR z analizą przyrostu produktu w czasie rzeczywistym (ang. Real-Time PCR) . Zostało opracowanych kilka metod do analizy przyrostu ilości produktów w reakcji PCR - wszystkie oparte są na związkach fluorescencyjnych. Wymagają one specjalnie przystosowanego do tego celu termocyklera, który sprzężony jest z fluorymetrem umożliwiającym pomiar fluorescencji w trakcie trwania reakcji PCR.
W mieszaninie reakcyjnej startery lub sonda wyznakowane są fluorescencyjnie. Podczas reakcji dochodzi do przeniesienia energii zaadsorbowanej przez jeden fluorochrom na drugi, który emituje światło lub dochodzi do wygaszenia emisji fluorochromu przez związek wygaszający. Zasada metody Real-Time PCR to - przyłącz (sondę), potnij (sondę), policz. Używana w Real-Time PCR sonda, jest krótką sekwencją oligonukleotydową komplementarną do sekwencji matrycy. Przyłącza się tuż za starterem-R w kierunku 5' matrycy. Posiada związane dwa barwniki: fluorescencyjny barwnik reporterowy na końcu 5' oraz tłumiący go barwnik „quencher"- Q na końcu 3'. Odległość pomiędzy barwnikami jest na tyle mała, że reporter oddaje energię quencherowi. Quencher emituje ją w postaci wiązki energii odczytywanej przez laser. Zadaniem sondy jest przyłączyć się (hybrydyzować) do matrycy tuż za starterem w kierunku 3'. Wolna grupa fosforanowa na końcu 3' sondy sprawia, że Polimeraza Taq, rozpoznaje sondę jako „intruza", trawi ją, by prowadzić dalej reakcję amplifikacji. Strawienie sondy sprawia, że reporter i quencher oddalają się od siebie na odległość uniemożliwiającą wzajemne oddziaływanie. Nie uaktywniony reporterem quencher przestaje emitować wiązkę energii. W efekcie laser urządzenia odczytuje sygnał barwnika reporterowego i oblicza liczbę kopii analizowanego genu.


Wykrywanie obecności Salmonella i Listeria monocytogenes odbywa się na zasadzie wykrywania fluorescencyjnych produktów topnienia powstałych po amplifikacji w reakcji PCR. Wykrywanie obecności odbywa się w trzech kolejnych etapach : izolacji DNA, amplifikacji regionu docelowego szukanego patogenu, detekcji produktów reakcji PCR. System Bax do molekularnej detekcji patogenów w żywności wykrywa tylko ściśle określone fragmenty DNA szukanego patogenu nie zanieczyszczonego czynnikami środowiskowymi. Szukany rejon DNA jest ściśle określony tylko dla szukanego drobnoustroju .

Technologia z użyciem reakcji PCR pozwala Systemowi Bax na specyficzną i szybką amplifikację DNA. Po procesie lizy próbki, System Bax wykonuje jednocześnie proces amplifikacji i detekcji produktów reakcji PCR.