icon320x320        argenta-logo-jakosc

Escherichia coli jest bakterią powszechnie występującą w przewodzie pokarmowym ludzi  i zwierząt ciepłokrwistych. Należy do rodziny Enterobacteriaceae, jest gram-ujemną, krótką  (1,1-1,5 x 2,0-6,0 µm), prostą pałeczką mezofilną, względnie beztlenową, nie wytwarzającą przetrwalników. Dzięki urzęsieniu perytrychalnym jest zdolna do ruchu. Optymalne pH do wzrostu wynosi 5,2 - 8,4. Większość szczepów E. coli jest nieszkodliwych, występujących w organizmie jako naturalna mikroflora przewodu pokarmowego. Jednakże niektóre szczepy E. coli są patogenne i te zostały podzielone na typy ze względu na czynniki wirulencji:

 

  • Shigatoksyczne STEC
  • Werotoksyczne VTEC w tym serotyp O157:H7
  • Enteropatogenne EPEC
  • Enterotoksyczne ETEC
  • Enteroinwazyjne EIEC
  • Enteroagregacyjne EAEC
  • Adherencyjne DAEC


Głównym źródłem występowania patogennych E. coli jest żywność pochodzenia zwierzęcego  i roślinnego. Zagrożenie stanowi spożycie surowego i niedogotowane mięsa (głównie wołowina, wieprzowina), produktów świeżych zanieczyszczonych odchodami (kiełki, warzywa, owoce), niepasteryzowanych soków owocowych i warzywnych oraz mleka niepasteryzowanego i pochodzących z niego produktów. Do zakażenia może dojść także na skutek bezpośredniego kontaktu ze zwierzęciem, które jest nosicielem bakterii lub zakażoną osobą nieprzestrzegającą zasad higieny. Patogenne E. coli spotkać można także w kąpieliskach, gdzie zbiornik wodny został skażony fekaliami.


Dawka infekcyjna wynosi ok. 100-200 komórek bakterii, a inkubacja w ciele może trwać  3-8 dni. Pierwsze oznaki zachorowania objawiają się skurczami brzucha, gorączką, biegunką (może występować krwawa biegunka - krwotoczne zapalenia okrężnicy), w ciężkich przypadkach może dojść m.in. do hemolitycznego zespołu mocznicowego, niewydolność nerek, małopłytkowość i anemii hemolitycznej. Ze wszystkich patogennych E. coli największe znaczenia dla bezpieczeństwa człowieka ma serotyp O157:H7, ze względu na wytwarzane toksyny powodującej najostrzejsze objawy kliniczne. Badanie żywności w kierunku E. coli O157:H7 zostało uwzględnione w Rozporządzeniu Komisji (WE) nr 2073/2005 z dnia 15 listopada 2005 r. w sprawie kryteriów mikrobiologicznych dotyczących środków spożywczych wraz z późniejszymi zmianami. 

 

Identyfikacja E. coli O157:H7 może odbywać się metodą klasyczną, która oparta jest na izolacji kolonii na podłożu selektywnym i wykonaniu szeregu potwierdzeń lub metodami opartymi na biologii molekularnej dzięki którym można wykryć gen kodujący markery patogenności.  Metoda klasyczna została opisana w normie PN-EN ISO 16654:2002 „Mikrobiologia żywności  i pasz. Horyzontalna metoda wykrywania Escherichia coli O157”. Według tej normy wykrywanie E. coli O157 obejmuje cztery etapy:

  1. Namnażanie – naważka umieszczona w zmodyfikowanym bulionie tryptonowo - sojowym z nowobiocyną (mTSB+N) inkubowana jest w 41,5 °C ± 1 °C praz 6 godzin i następnie przez dalsze 12-18 godzin po separacji immunomagnetycznej.
  2. Separacja i koncentracja drobnoustrojów za pomocą cząstek immunomagnetycznych opłaszczonych przeciwciałami anty E.coli O157.
  3. Izolacja za pomocą posiewu immunomagnetycznych cząstek z przylegającymi bakteriami na pożywkę MacConkey z cefiximem, tellurynem, sorbitolem (CT-SMAC) i na drugą pożywkę agarową do wyboru przez laboratorium.
  4. Potwierdzanie kolonii sorbitolo - ujemnych pobranych z pożywki CT-SMAC i typowych kolonii E. coli z drugiej pożywki izolacyjnej z uwzględnieniem wytwarzania indolu i aglutynacji z surowicą E. coli O157. 

Procedura opisana w normie PN-EN ISO 16654:2002 jest bardzo pracochłonna i kosztochłonna, niesie ryzyko popełnienia błędu przy oznaczaniu, ponieważ wymaga wykonania wielu czynności manualnych. Może być także zawodna dla trudnych matryc takich jak np. ser, produkty tłuste, a ponadto wymaga dodatkowego wyposażenia laboratorium. W związku z tym coraz większym zainteresowaniem wśród laboratoriów badających żywność cieszy się metoda PCR.


Reakcja PCR (polymerase chain reaction), jest to łańcuchowa reakcja polimerazy. Technika  ta polega na powieleniu konkretnego fragmentu DNA o określonej długości nukleotydów. Łańcuchowa reakcja polimerazy polega na przeprowadzeniu wielu cyklicznych reakcji syntezy nici DNA, które odbywają się w termocyklerze. Tremocykler jest urządzeniem służącym do sterowania temperaturą procesu oraz również do odczytu i interpretacji wyników. Aby przystąpić do reakcji PCR należy badaną próbkę odpowiednio przygotować. Na początku należy uzyskać materiał genetyczny o odpowiedniej jakości i koncentracji DNA za pomocą lizy komórek mikroorganizmów. Zestawy do samej reakcji PCR w zależności od rodzaju reakcji (standardowa, qPCR itd.) zawierają: primery (inaczej startery), czyli nukleotydowe sekwencje flankujące znany odcinek DNA, termostabilną polimerazę DNA, substancje stabilizujące polimerazę znajdujące się w buforach dostarczanych razem z polimerazą, charakterystyczne barwniki i/lub sondy. Wszystkie te składniki mogą być zaprojektowane w formie gotowej do uwodnienia, stabilnej, suchej tabletki tak jak ma to miejsce w zestawach oferowanych przez firmę ARGENTA.


Proces PCR odbywa się w wysokiej temperaturze (około 95°C), w której dochodzi  do denaturacji podwójnej nici DNA (rozdzielenia się na dwie) w wyniku pękania wiązań wodorowych pomiędzy zasadami azotowymi (purynami i pirymidynami). W temperaturze niższej, ściśle określonej dla danej pary starterów (najczęściej w przedziale 45-65°C), następuje asocjacja starterów do matrycy. Podwyższenie temperatury do około 72°C powoduje przyłączenie się polimerazy DNA do miejsca asocjacji starterów z matrycą DNA. Powstały kompleks rozpoczyna syntezę nici DNA komplementarnej do matrycy. Po zakończeniu pierwszego cyklu reakcji następuje kolejny, czyli: denaturacja, przyłączanie starterów oraz synteza nici DNA. Po ostatnim cyklu, w temperaturze 72 °C, przez okres zazwyczaj 5 minut następuje końcowe wydłużanie.

 

Szczepy STEC zawierają geny kodujące czynniki chorobotwórcze, zarówno zlokalizowane w obrębie chromosomu, jak i plazmidów, których produkty odgrywają szereg funkcji w patogenezie infekcji. Należą do nich substancje toksyczne, elementy biorące udział w adhezji bakterii do komórek nabłonkowych oraz markery wpływające na regulacje czynników kolonizacyjnych. Najważniejszym elementem patogenności szczepów STEC jest kodowana przez gen stx toksyna Shiga (Stx), występująca w dwóch podstawowych odmianach: Stx1 oraz Stx2, różniących się między sobą składem aminokwasowym, strukturą antygenów i aktywności biologiczną. Shigatoksyczne szczepy E.coli mogą wytwarzać tylko Stx1, tylko Stx2 lub też obie toksyny równocześnie.

 

Aby zapobiec zakażeniom Escherichia coli należy przestrzegać zasad higieny oraz kontroli na poszczególnych etapach łańcucha żywnościowego, począwszy od pierwotnej produkcji rolnej w gospodarstwie, przetwarzania i wytwarzania produktów żywnościowych, aż do przygotowania posiłków w gospodarstwach domowych i placówkach żywienia zbiorowego. Z powodu realnego zagrożenia dla zdrowia i życia ludzkiego oraz pojawiających się ognisk zachorowań wywołanych przez E. coli O157:H7 coraz częściej wykonuje się badania żywności właśnie w tym kierunku. Ze względu na to, że metoda PCR jest rozwiązaniem bardzo czułym, szybkim i nowoczesnym, zyskującym coraz większą popularność w diagnostyce laboratoryjnej należy przypuszczać, że w najbliższych latach może stać się standardową metodą identyfikacji E. coli O157:H7. Firma ARGENTA zachęca do zapoznania się z całą ofertą na testy do diagnostyki metodą PCR.

Aktualności

Wiadomości